新生命干細(xì)胞公司NK細(xì)胞體外擴(kuò)增技術(shù)獲重大突破
2017-10-18
近期，四川新生命干細(xì)胞科技股份有限公司研發(fā)團(tuán)隊(duì)(以下簡(jiǎn)稱“公司研發(fā)團(tuán)隊(duì)”)發(fā)明的“一種可用于同種異體回輸?shù)母呒兌萅K體外擴(kuò)增方法”已向國家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局申請(qǐng)發(fā)明專利并獲得受理(以下簡(jiǎn)稱“本發(fā)明專利方法”)，有望在抗擊惡性腫瘤的治療中發(fā)揮重要作用。
NK細(xì)胞(自然殺傷細(xì)胞)作為機(jī)體防御體系的第一道防線，不僅可以在天然免疫系統(tǒng)發(fā)揮其主要?dú)⒘鲂?yīng)，而且在免疫反應(yīng)的早期還可以分泌不同的細(xì)胞因子和各種趨化因子來調(diào)節(jié)機(jī)體的獲得性免疫應(yīng)答，是機(jī)體發(fā)揮免疫效應(yīng)不可或缺的效應(yīng)細(xì)胞。
近年來，NK細(xì)胞因其細(xì)胞殺傷活性高，起效快，且不受人主要組織相容性復(fù)合體(MHC)限制等優(yōu)點(diǎn)，相對(duì)其它用于免疫治療的細(xì)胞受到了更廣泛的關(guān)注和臨床應(yīng)用。但是NK細(xì)胞在外周血中僅占淋巴細(xì)胞的10%-15%，在臍帶血中的含量更低，只有5%左右，其數(shù)量和純度尚不能滿足臨床治療的需要。
經(jīng)過反復(fù)實(shí)驗(yàn)，公司研發(fā)團(tuán)隊(duì)通過對(duì)傳統(tǒng)方法的改進(jìn)和優(yōu)化，發(fā)明了一種操作步驟相對(duì)簡(jiǎn)便，安全高效的可用于同種異體回輸?shù)母呒兌萅K體外擴(kuò)增方法，該方法的優(yōu)勢(shì)主要體現(xiàn)在：
圖1不同分離方法分離純化NK細(xì)胞的效果， A分離純化前NK細(xì)胞所占淋巴細(xì)胞的比率，B用Ficoll淋巴細(xì)胞分離液
分離方法分離純化后NK細(xì)胞所占淋巴細(xì)胞的比率，C本發(fā)明專利方法分離純化后NK細(xì)胞所占淋巴細(xì)胞的比率
1、純度高
本發(fā)明專利方法與傳統(tǒng)的Ficoll淋巴細(xì)胞分離液分離方法相比，分離獲得的NK細(xì)胞純度可達(dá)98%以上，操作步驟簡(jiǎn)單，減少了中間環(huán)節(jié)污染的可能性，分離純化的操作時(shí)間也由4小時(shí)降低至1小時(shí)左右(見圖1);培養(yǎng)14天后，本發(fā)明專利方法本發(fā)明專利方法培養(yǎng)的NK細(xì)胞陽性率高達(dá)99.8%，顯著高于傳統(tǒng)方法的55.4%(見圖2)。
本發(fā)明專利方法所制備的NK細(xì)胞，排除了T細(xì)胞，Treg細(xì)胞，B細(xì)胞的污染，對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性高，可滿足美國NHLBI(National heart, lung and blood Insititute)用于同種異體回輸?shù)臉?biāo)準(zhǔn)(CD3-CD56+NK細(xì)胞達(dá)到90%以上，CD19+B細(xì)胞和CD3+T細(xì)胞低于5%)，不但可用于自體NK回輸，也可以用于同種異體NK的回輸。
圖2 培養(yǎng)14天CD3-CD56+NK細(xì)胞的陽性率，A傳統(tǒng)方法、B本發(fā)明專利方法
2、安全可靠
本發(fā)明專利方法創(chuàng)造性的使用Herceptin(赫塞汀)作為包被物來激活NK細(xì)胞，因此在培養(yǎng)過程中不再依賴于傳統(tǒng)方法所必需的飼養(yǎng)細(xì)胞,杜絕了異源生物污染，提高了使用安全性，同時(shí)避免了回輸后由于體內(nèi)和體外環(huán)境的差異對(duì)NK細(xì)胞在體內(nèi)的擴(kuò)增和殺傷活性的影響。同時(shí)，其分離純化及體外擴(kuò)增時(shí)間短;而且操作簡(jiǎn)單，減少了中間環(huán)節(jié)污染的可能性。
3、擴(kuò)增倍數(shù)高
本發(fā)明專利方法可以從外周血或臍帶血中高效擴(kuò)增NK細(xì)胞，可使其擴(kuò)增200-1000倍，獲得滿足臨床使用的NK細(xì)胞(見圖3)。
圖3 擴(kuò)增培養(yǎng)14天NK細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)
圖4 擴(kuò)增培養(yǎng)14天NK細(xì)胞對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞K562的殺傷活性，A、B傳統(tǒng)方法，C、D本發(fā)明專利方法
4.殺傷活性強(qiáng)
本發(fā)明專利方法所制備的NK細(xì)胞在靶效比1:1、1:2時(shí)，對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞K562的殺傷效率均顯著優(yōu)于傳統(tǒng)方法制備的NK細(xì)胞(1:1時(shí)，C本發(fā)明專利方法66.4%>A傳統(tǒng)方法19.3%;1:2時(shí)，D 本發(fā)明專利方法84.6%>B傳統(tǒng)方法25.8%)。
綜上所述，本發(fā)明專利方法提供的NK細(xì)胞分離培養(yǎng)方法，可以從外周血或臍帶血中高效獲得滿足臨床使用的NK細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)量多、純度高、殺傷活性好，在同種異體NK回輸方面具有突出優(yōu)勢(shì)，而且本發(fā)明專利方法操作簡(jiǎn)單、分離培養(yǎng)時(shí)間短，具有良好的應(yīng)用前景。
